負(fù)染色技術(shù)是一種制備電子顯微鏡樣品圖像呈現(xiàn)復(fù)反差的技術(shù)。用于觀察樣品中的顆粒性物質(zhì)或生物大分子。用金屬鹽對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色，使整個(gè)載網(wǎng)都鋪上一層重金屬鹽，而有凸出顆粒的地方則沒有染料沉積。染色后，在電鏡下觀察時(shí)，被觀察的對(duì)象為亮的，背景為暗的。負(fù)染色是只染背景而不染樣品，與光學(xué)顯微鏡樣品的染色正好相反。目前最常用的負(fù)染液是醋酸鈾或者磷鎢酸。

　　制樣步驟

　　常用的負(fù)染制樣方法有混合法、懸滴法、漂浮法等，本實(shí)驗(yàn)室常用的是懸滴制樣法，具體制樣流程如下：

　　1、樣品準(zhǔn)備：首先，將稀釋后的生物樣品滴在載網(wǎng)上，通常是涂布在一個(gè)網(wǎng)格狀的銅或鎳網(wǎng)上的小洞(也稱井)內(nèi)。

　　2、負(fù)染色劑添加：隨后迅速滴加一種高電子密度的染色劑，如磷鎢酸、醋酸鈾等。這些染料對(duì)電子束有很強(qiáng)的散射作用，在TEM下顯示出明顯的暗色背景。

　　3、吸附與干燥：染色劑溶液圍繞并滲透進(jìn)入樣品內(nèi)部，但不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，而是通過物理吸附形成一層包裹樣品的高密度外殼。然后樣品經(jīng)過自然揮發(fā)或加速干燥，使染色劑固定在樣品周圍及可能的部分內(nèi)部空隙中。

　　4、電鏡觀察：在透射電鏡下觀察時(shí)，由于高電子密度的染色劑形成的背景區(qū)域?qū)﹄娮拥奈栈蛏⑸淠芰^強(qiáng)，因此在圖像上呈現(xiàn)為暗色;而樣品因其較低的電子密度相對(duì)顯得較為透明或亮色，從而與暗色背景形成鮮明對(duì)比，使得樣品的輪廓和形態(tài)特征得以清晰顯現(xiàn)。