高效液相色譜(HPLC)是測定氨基酸含量的一種非常有效的方法，尤其適用于復雜基質中的氨基酸分析。下面是使用HPLC測定氨基酸含量的基本步驟和技術要點：

　　樣品前處理

　　由于氨基酸在反相HPLC條件下不易保留或分離，通常需要對樣品進行衍生化處理以增強其檢測靈敏度和改善分離效果。

　　水解：對于蛋白質或多肽樣品，首先需要通過酸水解(如6M HCl，110°C下水解24小時)將其轉化為游離氨基酸。此過程需注意防止某些氨基酸(如色氨酸、半胱氨酸)在強酸條件下發(fā)生降解。

　　去離子水稀釋：將水解后的溶液用去離子水適當稀釋，并調節(jié)pH值至中性。

　　衍生化：為了提高檢測靈敏度和改善峰形，常用熒光標記試劑對氨基酸進行衍生化處理。常用的衍生化試劑包括：

　　OPA(鄰苯二甲醛)，用于一級胺的即時衍生化;

　　FMOC-Cl(9-芴甲氧羰酰氯)，常與OPA結合使用，專門針對伯胺;

　　PITC(苯異硫氰酸酯)，可形成更穩(wěn)定的衍生物;

　　DNFB(丹磺酰氯)，適合于氨基酸的柱前衍生化。

　　HPLC條件設置

　　色譜柱選擇

　　反相C18柱是常用的類型，因其具有良好的通用性和分辨率。

　　對于特定應用，也可能選擇其他類型的柱子，比如親水作用液相色譜(HILIC)柱，特別適用于極性化合物的分離。

　　流動相組成

　　一般采用梯度洗脫模式，起始流動相可以是含有緩沖鹽(如磷酸鹽緩沖液，pH 6.5-7.5)和少量有機溶劑(如乙腈或甲醇)的混合物。

　　隨著梯度的推進，逐漸增加有機溶劑的比例以促進不同氨基酸的洗脫。

　　檢測器選擇

　　熒光檢測器：當使用了熒光標記試劑時，這是首選的檢測方式，因為它提供了高靈敏度和選擇性。

　　紫外檢測器：如果未進行衍生化，則可以使用UV檢測器，但靈敏度較低。

　　蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD) 或者 質譜(MS)：對于一些難以檢測的情況，也可以考慮這些替代方案。

　　數(shù)據(jù)分析

　　標準曲線法：制備一系列已知濃度的氨基酸標準溶液，在相同條件下進樣，繪制標準曲線。然后根據(jù)樣品峰面積與標準曲線比較來定量未知樣品中的氨基酸含量。

　　內標法：添加一種或多種內標物到樣品中，通過比較內標物與目標化合物的響應比來進行定量分析，這種方法有助于減少實驗誤差。

　　注意事項

　　衍生化反應條件必須嚴格控制，包括溫度、時間及試劑用量等，以確保重現(xiàn)性和準確性。

　　在整個操作過程中要避免污染，特別是對于微量分析尤為重要。

　　定期維護HPLC系統(tǒng)，確保泵、進樣器、色譜柱和檢測器處于z佳工作狀態(tài)。