考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue, CBB)測定法是一種廣泛用于定量測定溶液中蛋白質濃度的方法。這種方法基于考馬斯亮藍G-250染料與蛋白質結合后顏色變化的原理，具體來說，當考馬斯亮藍G-250與蛋白質中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基結合時，會發(fā)生從棕紅色到藍色的顏色變化。這種顏色變化可以通過分光光度計在特定波長下測量吸光度來定量分析。

　　考馬斯亮藍測定蛋白質含量的基本步驟

　　標準曲線制作：

　　準備一系列已知濃度的蛋白質標準溶液(如牛血清白蛋白BSA)，通常濃度范圍為0至1000 μg/mL。

　　向每個標準溶液中加入適量的考馬斯亮藍試劑，并充分混合。

　　在室溫下靜置一段時間(通常是5到30分鐘)，讓顏色完全發(fā)展。

　　使用分光光度計，在595 nm波長處測量各標準溶液的吸光度值。

　　繪制吸光度相對于蛋白質濃度的標準曲線。

　　樣品測定：

　　將待測樣品稀釋至適當?shù)臐舛确秶?如果需要的話)，然后同樣加入考馬斯亮藍試劑并混勻。

　　讓顏色發(fā)展一段時間后，在相同的條件下測量樣品溶液的吸光度。

　　根據(jù)標準曲線計算出樣品中蛋白質的濃度。

　　注意事項

　　緩沖液選擇：某些緩沖液成分可能會干擾測定結果，比如含有去垢劑、巰基乙醇或高濃度的鹽等，因此在實驗設計時應盡量避免使用這些成分。

　　樣品預處理：對于復雜的生物樣品，可能需要進行預處理以去除可能干擾測定的物質。

　　時間控制：顏色發(fā)展的z佳時間窗口有限，應在規(guī)定時間內(nèi)完成所有測量，以保證結果準確性。

　　線性范圍：了解所使用的考馬斯亮藍試劑的線性響應范圍非常重要，超出此范圍可能導致不準確的結果。