細(xì)胞油紅O染色是一種常用的組織化學(xué)方法，主要用于檢測(cè)和定量細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累情況。這種方法廣泛應(yīng)用于脂肪細(xì)胞生物學(xué)、動(dòng)脈粥樣硬化研究以及評(píng)估細(xì)胞在不同條件下的脂質(zhì)代謝狀態(tài)等。以下是關(guān)于油紅O染色及其定量的基本步驟和技術(shù)要點(diǎn)。

　　油紅O染色步驟

　　樣品準(zhǔn)備

　　對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞：先用PBS清洗細(xì)胞2-3次以去除培養(yǎng)基殘留。

　　對(duì)于冷凍切片或固定后的組織樣本：確保樣本已經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚?如4%多聚甲醛固定)并置于載玻片上。

　　固定

　　使用10%中性緩沖福爾馬林或4%多聚甲醛固定細(xì)胞或組織切片，通常固定時(shí)間為10-20分鐘。

　　固定后再次用PBS清洗。

　　染色液制備

　　制備新鮮的60%異丙醇溶液中的油紅O工作液。一般推薦將0.5% (w/v)的油紅O儲(chǔ)液與60%異丙醇按比例混合，并過(guò)濾除去不溶物。

　　染色

　　將固定并清洗過(guò)的樣本浸泡于預(yù)冷的油紅O染色液中，室溫下染色15-30分鐘。

　　染色完成后，用60%異丙醇快速?zèng)_洗掉多余的染料，然后用水洗去殘留酒精。

　　封片觀察

　　可直接用顯微鏡觀察染色結(jié)果，或者用含甘油的封片劑覆蓋樣本后加蓋蓋玻片長(zhǎng)期保存。

　　定量分析

　　直接視覺(jué)評(píng)估

　　通過(guò)顯微鏡觀察染色強(qiáng)度來(lái)粗略估計(jì)脂質(zhì)含量的變化。這種方法主觀性強(qiáng)，適合初步篩查。

　　圖像分析軟件定量

　　圖像采集：使用光學(xué)顯微鏡拍攝染色樣本的照片。

　　圖像處理：

　　導(dǎo)入圖像到專業(yè)的圖像分析軟件(如ImageJ)。

　　轉(zhuǎn)換圖像色彩模式為灰度圖或二值化處理，以便于區(qū)分背景和染色區(qū)域。

　　設(shè)置閾值以突出顯示被染色的脂滴。

　　測(cè)量選定區(qū)域內(nèi)所有脂滴的總面積或平均面積作為脂質(zhì)含量的指標(biāo)。

　　光密度測(cè)定

　　如果需要更精確地量化染色強(qiáng)度，可以采用分光光度計(jì)測(cè)量溶解于特定溶劑中的染料吸光度。具體步驟如下：

　　在染色完畢后，從載玻片上去除油紅O，將其溶解于100%異丙醇中。

　　使用分光光度計(jì)在520 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值，該值與樣本中的脂質(zhì)含量成正比。

　　注意事項(xiàng)

　　確保使用的油紅O染料純度足夠高，避免雜質(zhì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　　控制好染色時(shí)間和溫度，因?yàn)樗鼈儠?huì)影響染色效果。

　　樣本之間的比較應(yīng)在相同條件下進(jìn)行，包括染色時(shí)間、顯微鏡設(shè)置等，以保證數(shù)據(jù)的一致性和可靠性。