一、RNAscope技術(shù)核心優(yōu)勢

　　RNAscope是Advanced Cell Diagnostics(ACD)開發(fā)的第三代RNA原位雜交技術(shù)，具有單分子級檢測靈敏度，突破傳統(tǒng)ISH技術(shù)的局限：

　　超高特異性：采用ZZ探針設(shè)計(雙Z探針)，有效減少非特異性結(jié)合

　　單拷貝檢測：可識別<1 copy/cell的RNA分子

　　兼容性強：支持FFPE樣本、冰凍切片及細(xì)胞涂片

　　多重檢測：同一組織切片z多同步檢測4種RNA靶標(biāo)(需配合TSA熒光系統(tǒng))

　　二、標(biāo)準(zhǔn)操作流程(SOP)與關(guān)鍵參數(shù)

　　1. 實驗準(zhǔn)備階段

　　2. 核心反應(yīng)流程

　　探針雜交：40℃孵育2小時(Hyb Oven)

　　信號放大：6級級聯(lián)放大(AMP1-6，每級15分鐘)

　　顯色檢測：DAB顯色時間2-10分鐘(顯微鏡監(jiān)控)

　　三、關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)與驗證方法

　　1. 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)

　　陽性對照：選用PPIB/HPRT1等看家基因(信號強度≥3+)

　　陰性對照：DapB探針對照(背景信號≤1+)

　　靈敏度驗證：使用RNAscope陽性對照玻片(ACD 310043)

　　2. 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

　　四、臨床應(yīng)用場景與典型案例

　　1. 腫瘤精準(zhǔn)診斷

　　EBER檢測：鼻咽癌診斷(敏感性98.7%，特異性100%)

　　HER2 RNA表達(dá)：乳腺癌靶向治療指導(dǎo)(對比IHC/FISH符合率>95%)

　　PD-L1 mRNA定位：免疫治療療效預(yù)測

　　2. 病原體檢測

　　HPV分型：同步檢測16/18/33型(檢出限<10 copies/cell)

　　新冠病毒RNA：組織內(nèi)病毒定位研究(Autopsy標(biāo)本驗證)

　　五、常見問題解決方案(FAQ)

　　Q1：信號弱或無信號如何優(yōu)化?

　　A：分步排查：①延長蛋白酶消化(+5min梯度) ②提高探針濃度(1.5×) ③增加AMP4孵育時間

　　Q2：背景噪音過高如何處理?

　　A：優(yōu)先調(diào)整：①縮短顯色時間 ②增加洗滌次數(shù)(3×5min) ③降低探針工作濃度

　　Q3：多重?zé)晒馊旧绾卧O(shè)置?

　　A：需使用TSA系列試劑盒(Opal 520/570/620/690)，每輪染色后需微波處理(98℃ 15min)剝離抗體